起源于上世紀(jì)60年代末的高效液相色譜技術(shù)（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，建立在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，開始了高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測(cè)器各技術(shù)不斷進(jìn)步的旅程。其以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。

解析真實(shí)世界的奧秘幾乎都要用到分離技術(shù)，有機(jī)物構(gòu)成了物質(zhì)世界的絕大部分，而超過80%的有機(jī)物，大都采用HPLC進(jìn)行分離和分析。因此，液相色譜構(gòu)成了科學(xué)儀器領(lǐng)域極大的單品類，其市場(chǎng)之大讓許多企業(yè)魂?duì)繅?mèng)縈，無(wú)數(shù)企業(yè)前赴后繼地進(jìn)入液相色譜市場(chǎng)。

誕生與發(fā)展

1903年，俄國(guó)植物學(xué)家Tswett在會(huì)議上報(bào)道了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法（后來(lái)文獻(xiàn)發(fā)表于1906年），Tswett將這種方法命名為色譜（Chromatography），管內(nèi)填充物被稱之為固定相，沖洗劑被稱之為流動(dòng)相。

1941年，Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙?；被?，與Synge一同提出著名的色譜塔板理論，兩人獲得了1952年的Nobel獎(jiǎng)。液固色譜被創(chuàng)立后的50多年時(shí)間里，液固色譜裝置并無(wú)實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)；直到20世紀(jì)60年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，人們把氣相色譜中獲得的系統(tǒng)理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用于液相色譜研究。

1966年，耶魯大學(xué)的Horvath首次提出高效液相色譜（HPLC）這個(gè)名稱，后于1967年開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了HPLC的時(shí)代。1972-1974年，6000 psi泵、10μm粒徑色譜柱和無(wú)隔墊進(jìn)樣器的引入，標(biāo)志著HPLC從“高壓”向“高效”的轉(zhuǎn)變。液相色譜與光學(xué)檢測(cè)器相結(jié)合，也使HPLC不僅可分離，還可同時(shí)完成分析任務(wù)，成就一套分離分析系統(tǒng)。

1973年，第一屆HPLC會(huì)議在瑞士因特拉肯舉行，1982年后每年舉辦。20世紀(jì)70年代末至80年代初，HPLC開發(fā)了分離肽和蛋白質(zhì)的方法，為今日蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥分析奠定了基礎(chǔ)。

1979年至80年代初，開發(fā)了用HPLC分離對(duì)映體的方法，最初采用在流動(dòng)相中加入修飾劑，后來(lái)開發(fā)了可分離對(duì)映體的固定相。20世紀(jì)80年代中后期，John Fenn開發(fā)了ESI離子源，成功用于LC-MS。

2004年前后，引入< 2μm粒徑的新系統(tǒng)，推動(dòng)耐壓15,000-20,000psi的UHPLC的出現(xiàn)。

商用發(fā)展史

1、色譜柱技術(shù)

色譜柱技術(shù)是儀器開發(fā)的主要驅(qū)動(dòng)因素之一。

1967年，耶魯大學(xué)的Csaba Horváth和同事們?cè)诒犹盍希ìF(xiàn)稱為表面多孔填料，SPP）方面的工作代表了HPLC柱和儀器技術(shù)的突破。50微米的球形玻璃珠涂有一層薄薄的聚苯乙烯樹脂聚合物層（1-3μm），衍生形成陰離子交換功能，并用于分離核苷酸。顆粒被裝入不銹鋼柱（內(nèi)徑1mm，長(zhǎng)度3米），這會(huì)產(chǎn)生高背壓，需要使用泵將溶劑推過柱。這代表一個(gè)開始的趨勢(shì)，即較小的顆粒會(huì)提高柱效，以提供更好的分離性能，同時(shí)也會(huì)增加柱背壓，使其與平均顆粒直徑成反比；因此，在接下來(lái)的幾年里，泵輸出壓力將成為一個(gè)重要因素。除此之外，流速、額外柱效應(yīng)（系統(tǒng)死體積）、峰寬減小、洗脫速度、樣品通量和檢測(cè)器能力等參數(shù)都成為改善HPLC系統(tǒng)所有部分的驅(qū)動(dòng)因素。

2、第一臺(tái)HPLC的誕生

經(jīng)過色譜柱技術(shù)的發(fā)展，他們自制了梯度洗脫系統(tǒng)，使用兩臺(tái) Milton Roy 微型泵。梯度由一個(gè)含有弱溶劑的攪拌儲(chǔ)液池開始形成；然后由一個(gè)泵向該儲(chǔ)液池輸送受控但不斷增加的強(qiáng)溶劑量；第二臺(tái)高壓泵將越來(lái)越濃的溶劑混合物從儲(chǔ)液池推到色譜柱上；用一個(gè)帶有8μL流動(dòng)池的改良分光光度計(jì)檢測(cè)。

1967年，他們與Picker Nuclear公司合作，推出第一臺(tái)商用HPLC：LCS-1000。一個(gè)高壓泵（高達(dá)4000psi）、一個(gè)進(jìn)樣Loop閥、一個(gè)柱溫箱、裝有上述薄層填料的色譜柱，以及一個(gè)基于低壓汞蒸氣燈的固定波長(zhǎng)檢測(cè)器（254 nm）成就了LCS-1000。1968年，該技術(shù)被Varian 公司收購(gòu)（Varian后被安捷倫收購(gòu)）。

同年，Waters推出首臺(tái)HPLC系統(tǒng)ALC-100（ALC是分析液相色譜儀的首字母縮寫），它改進(jìn)了原有GPC-100系統(tǒng)，減少死體積，采用更高壓力的Milton Roy泵，流通紫外檢測(cè)器和（可選）和折射率（RI）檢測(cè)器。Waters將其品牌口號(hào)“Ther Liquid Chromatography People“注冊(cè)成商標(biāo)，成為了LC的代名詞。1972年，在Robert B.Woodward 及其博士后Helmut Hamberger的指引下，分離維生素B-12合成過程中中間體的異構(gòu)體；從此HPLC打開了有機(jī)合成的市場(chǎng)。

色譜學(xué)家傾向于將HPLC的起源推至更早期的1964年。

杜邦公司的Jack Kirkland在參觀Eidhoven理工大學(xué)時(shí)，在一間實(shí)驗(yàn)室里看到Josef F. K. Huber已在自制粗糙的HPLC儀器，帶有紫外檢測(cè)器，在GC顆粒上包裹液體（和流動(dòng)相不混溶）后填充了色譜柱。參觀后，Kirkland說服杜邦公司的經(jīng)理讓他研制HPLC，進(jìn)行GC無(wú)法全部勝任的農(nóng)藥分離。

到1969年，杜邦公司推出820型集成色譜儀，有一個(gè)恒壓泵、一個(gè)自制的UV 254 nm檢測(cè)器（410型）和ZIPAX SPP色譜柱。并推出了第一批化學(xué)鍵合相，徹底改變了梯度HPLC的實(shí)踐。島津公司于同年開發(fā)出GPC系統(tǒng)，并于1972年與杜邦簽訂許可合同后開始制造銷售LC-1（LC-830），1978年推出自主研制的LC-3A，以CDQR方式的單柱塞型送液?jiǎn)卧獮樘卣鳌?/span>

3、進(jìn)樣閥的演變

當(dāng)杜邦和Waters將新的SPP填料（37-50μm粒徑范圍）裝入標(biāo)準(zhǔn)柱（內(nèi)徑2.1 mm，長(zhǎng)度50或100 cm）時(shí)，背壓適中，因此第一臺(tái)商用液相色譜儀采用了在線GC隔墊進(jìn)樣器。

隨著填料顆粒變小，隔墊進(jìn)樣器的耐壓能力不足，促使停流（stop-flow）技術(shù)的出現(xiàn)。這種手動(dòng)進(jìn)樣很麻煩，限制了樣品的通量，因此Valco的創(chuàng)始人Stan Stearns調(diào)整了GC閥，使進(jìn)樣壓力達(dá)到4500 psi。六通進(jìn)樣閥在生產(chǎn)率和重現(xiàn)性方面取得了真正的突破，并通過改變樣品Loop定量環(huán)尺寸，使進(jìn)樣體積更靈活，還促進(jìn)了后來(lái)進(jìn)樣器的自動(dòng)化。

Waters在其集成LC系列中使用了六通進(jìn)樣閥后，1973年推出了自己的U6K進(jìn)樣器，可進(jìn)行方便、可變體積和可靠的進(jìn)樣，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。該進(jìn)樣器還具有一個(gè)創(chuàng)新的旁路通道，可在閥門循環(huán)時(shí)降低壓力沖擊，從而保護(hù)色譜柱在重復(fù)進(jìn)樣后不會(huì)損壞。

后來(lái)，Rheodyne公司于1976年推出7125型進(jìn)樣閥，對(duì)Valco方法進(jìn)行了改進(jìn)，使進(jìn)樣器將樣品注射入閥的中心，可使用單個(gè)Loop環(huán)實(shí)現(xiàn)可變的進(jìn)樣量。

4、模塊的崛起

早期的許多色譜用戶認(rèn)為，每個(gè)制造商各有優(yōu)勢(shì)，因而希望將最好的泵與最好的進(jìn)樣器、最好的檢測(cè)器等結(jié)合起來(lái)，目的是構(gòu)建一個(gè)具有快速可互換（或可升級(jí)）模塊的高級(jí)系統(tǒng)。為了滿足這樣的需求，一些制造商（尤其是OEM行業(yè)的制造商）決定開發(fā)可優(yōu)化性能的獨(dú)立模塊。

其中第一家是實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)控制公司（Laboratory Data Control，LDC），該司還利用EmmettWatson的服務(wù)構(gòu)建價(jià)格合理的獨(dú)立模塊，包括254 nm紫外檢測(cè)器。該檢測(cè)器成為多家色譜公司的主要OEM組件。規(guī)模更大的Milton Roy公司收購(gòu)了LDC，并成為許多HPLC公司和個(gè)人色譜儀的模塊供應(yīng)商。Valco和Rheodyne等零部件公司專門生產(chǎn)注射閥（進(jìn)樣閥）和切換閥。Schoefel、Cecil Instruments和Pye Unicam等檢測(cè)器公司開發(fā)了專門的探測(cè)器。許多較小的公司開發(fā)了其他外圍設(shè)備，可以根據(jù)需要快速更換。

5、液相泵的發(fā)展

Waters緊隨模塊潮流，開發(fā)了一款名為M-6000的獨(dú)立泵，這是第一款專門為HPLC開發(fā)的泵。M-6000使用了兩個(gè)往復(fù)式活塞，以便更平穩(wěn)地流向色譜柱。其6000 psi的額定壓力足以滿足20世紀(jì)70年代初引進(jìn)的25 cm柱（內(nèi)徑4.6mm）中10微米粒徑填料的要求。

Altex（后被貝克曼收購(gòu)）開發(fā)了全新概念的泵，使用可變活塞速度和快速再充滿（refill），由此產(chǎn)生的110型泵的流量比當(dāng)時(shí)大多數(shù)低成本的往復(fù)式泵都要平穩(wěn)。為了提供更高的壓力和非脈動(dòng)流量，瓦里安（后被安捷倫收購(gòu)）、Isco和Nester-Faust（后被珀金埃爾默收購(gòu)）選擇開發(fā)注射泵。

在這里，大容量（250毫升）活塞由精確的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)。這些泵基本上沒有脈沖，可以耐受高達(dá)6000 psi的高壓，后來(lái)達(dá)到8500 psi。對(duì)于二元梯度，需要兩個(gè)注射泵。但由于溶劑體積可壓縮性，色譜柱在梯度洗脫過程中遇到問題；進(jìn)入混合器的每種溶劑的實(shí)際流量與控制器上的編程不同，這會(huì)產(chǎn)生成分錯(cuò)誤——尤其是當(dāng)每臺(tái)泵的啟動(dòng)體積不同時(shí)。注射器泵雖然獨(dú)特新穎，但最終消失了。然而，注射泵值得一提，因?yàn)檫@項(xiàng)新技術(shù)試圖在提供無(wú)脈沖高壓流量時(shí)跳出框框思維。

6、工業(yè)3.0時(shí)代

在20世紀(jì)60年代末和70年代初，主要的數(shù)據(jù)輸出靠條形圖記錄儀。對(duì)于定量，通常采用手動(dòng)方法，如切割和稱重圖紙或使用機(jī)械求積儀。Autolab改變了這一切，后來(lái)是SpectraPhysics（后被賽默飛收購(gòu)又賣出，現(xiàn)屬Newport）的一個(gè)部門，它推出了System IV計(jì)算積分器，提供數(shù)字讀數(shù)。輸出可以表示為簡(jiǎn)單的面積百分比或基于方法中存儲(chǔ)的校準(zhǔn)因子。由于其較大的動(dòng)態(tài)范圍，色譜儀不再需要在調(diào)整信號(hào)衰減的同時(shí)進(jìn)行多次進(jìn)樣，從而提高了實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)率。

由微處理器控制的惠普HP 3380A積分器更進(jìn)一步，它既是記錄器又是字母數(shù)字打印機(jī)繪圖儀，因此所有信息都在一張圖表紙上。此后，許多制造商推出了自己的數(shù)據(jù)系統(tǒng)來(lái)補(bǔ)充HPLC硬件。1979年，Nelson Analytical開發(fā)了基于個(gè)人電腦的數(shù)據(jù)分析軟件，利用新的大規(guī)模集成電路（LSI）構(gòu)建模數(shù)轉(zhuǎn)換器，并提供具有強(qiáng)大計(jì)算能力的儀器控制和數(shù)據(jù)采集，成為許多制造商系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)。

在20世紀(jì)70年代中期，高效液相色譜法越來(lái)越多地被用于制藥和其它行業(yè)，用戶每天需要分析許多樣品。第一臺(tái)進(jìn)入市場(chǎng)的HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器來(lái)自Micromeritics公司，這是一家專門從事粒度測(cè)量的公司，他們于1974年推出708A型LC自動(dòng)進(jìn)樣器，使用旋轉(zhuǎn)托盤中的管狀小瓶。將一根針放入小瓶中，刺穿瓶蓋，同時(shí)一個(gè)套環(huán)將瓶蓋向下推入小瓶，將樣品送入進(jìn)樣環(huán)中。該系統(tǒng)可對(duì)小瓶中進(jìn)行1-3次取樣。到20世紀(jì)70年代末，大多數(shù)主要供應(yīng)商都推出了自己的自動(dòng)進(jìn)樣器。

7、集成液相系統(tǒng)的回歸

隨著HPLC被廣泛接受，儀器外圍設(shè)備的中央控制更有意義。模塊式LC概念正在失去支持，對(duì)于分析含有多種成分的樣品，梯度洗脫是必須的。產(chǎn)生二元梯度的雙泵系統(tǒng)（兩個(gè)泵在高壓側(cè)垂直連接在一起，需要一個(gè)混合器）產(chǎn)生。

惠普的分析部門（現(xiàn)為安捷倫科技）改進(jìn)了兩年前收購(gòu)的Hupe-Busch系統(tǒng)。HP 1084是第一款微處理器控制的LC，具有獨(dú)特的流量控制功能，并配有自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和外部熒光檢測(cè)器。1084的精確流量控制是很好的賣點(diǎn)，并具有高度可重復(fù)的保留時(shí)間。

由于兩個(gè)泵產(chǎn)生梯度系統(tǒng)的成本很高，因此，使用兩個(gè)或三個(gè)比例閥，可以生成二元或三元梯度，在方法開發(fā)過程中提供更大的靈活性。低壓梯度最終成為許多公司的標(biāo)準(zhǔn)，后來(lái)還開發(fā)了更強(qiáng)大的四元泵。1978年，瓦里安推出的LC-5000是第一款集成的高效液相色譜系統(tǒng)，它將低壓?jiǎn)伪锰荻裙δ?、關(guān)鍵功能的微處理器控制、用于設(shè)置方法的鍵盤和CRT顯示器集成在一個(gè)單元中。主動(dòng)式進(jìn)樣止回閥解決了止回閥粘性和注入損失的問題。1979年Spectra Physical推出的 Model 8000采用的設(shè)計(jì)與當(dāng)今儀器中使用的溶劑混合設(shè)計(jì)幾乎相同。

1975年，Dionex（后被賽默飛收購(gòu)）作為DurrumInstruments的一個(gè)部門成立，以應(yīng)對(duì)一個(gè)新興的色譜市場(chǎng)：離子色譜（IC）。Dionex很快成為分離無(wú)機(jī)和有機(jī)離子化合物的領(lǐng)導(dǎo)者。他們的專利由陶氏化學(xué)公司授權(quán)，包括：使用離子抑制器從流動(dòng)相中去除鹽，對(duì)分離的離子進(jìn)行電導(dǎo)檢測(cè)。Dionex還開發(fā)了專門的IC柱，用于嚴(yán)格分離如飲用水中的痕量溴酸鹽和鹵代氧化物，使用脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行碳水化合物分離，以及離子排斥分離。

8、多種色譜檢測(cè)器的問世

HPLC的前10年，光譜檢測(cè)器占主導(dǎo)地位。采用DAD光電二極管陣列檢測(cè)器后，可進(jìn)行實(shí)時(shí)光譜測(cè)量，并可以實(shí)時(shí)獲得完整的紫外-可見光譜，后成為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1977年，惠普推出了全球第一個(gè)DAD檢測(cè)器8450，為此后的DAD檢測(cè)器設(shè)定了黃金標(biāo)準(zhǔn)。隨著GC-MS的巨大成功，各種液相色譜的接口類型被開發(fā)出來(lái)，以結(jié)合兩種顯然不兼容的技術(shù)——一種在液體環(huán)境中，另一種在真空中。接口技術(shù)包括直接液體接口、傳輸設(shè)備、粒子束、連續(xù)流FAB、離子噴霧和熱噴霧。

第一個(gè)成功的LC-MS接口，使用的不是移動(dòng)的金屬絲，而是移動(dòng)的傳送帶，可以傳輸更多的樣本，以獲得更好的靈敏度。1987年，Vestec公司推出熱噴霧接口，熱噴霧是20世紀(jì)90年代之前使用最多的LC-MS接口。

耶魯大學(xué)的約翰?芬恩（John Fenn）開發(fā)了ESI電噴霧，可產(chǎn)生完整、高分子量、多重質(zhì)子化或去質(zhì)子化的離子。Jack Henion及其同事發(fā)了一種離子噴霧接口，使用霧化氮?dú)廨o助電噴霧操作；SCIEX（隸屬于丹納赫）使用了Henion專利，1989年推出第一款ESI類型的LC-MS接口。ESI現(xiàn)在是標(biāo)準(zhǔn)的LC-MS接口。

HPLC還發(fā)展了其它通用探測(cè)器。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）和帶電氣溶膠檢測(cè)器（CAD）均將LC流動(dòng)相流出物霧化成液滴，蒸發(fā)后留下非揮發(fā)性分析物的小顆粒?？偟膩?lái)說，2005年ESA Biosciences（先被Dionex收購(gòu)，現(xiàn)隸屬于賽默飛）推出的CAD檢測(cè)器比ELSD更靈敏，并更利于梯度。CAD還可以檢測(cè)所有非揮發(fā)性和許多半揮發(fā)性分析物，且響應(yīng)一致。

9、超高效時(shí)代

20世紀(jì)80-90年代的大部分時(shí)間里，液相色譜儀大都使用3-3.5μm或5μm顆粒、6000 psi泵和4.6 mm內(nèi)徑的色譜柱。

為了滿足快速分析的需要，研究者開發(fā)了亞2μm尺寸的填料，系統(tǒng)再次被推向更高的工作壓力；而且由此產(chǎn)生的粘性加熱效應(yīng)需要更窄內(nèi)徑的色譜柱，因此還需要顯著減少額外的色譜柱體積。2004年，Waters推出Acquity UPLC系統(tǒng)，滿足了21世紀(jì)初新的小顆粒短柱（5-15 cm）和更窄孔徑（內(nèi)徑2.0–2.1mm）的需求。Acquity對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)品/技術(shù)進(jìn)行了深思熟慮的組合，從而形成了一個(gè)具有合理低額外柱體積的實(shí)用系統(tǒng)。這項(xiàng)創(chuàng)新激勵(lì)其它十幾家公司推出類似的UHPLC產(chǎn)品。

10、其它創(chuàng)新

氣泡讓早期HPLC用戶很煩惱，流動(dòng)相中的氣泡會(huì)損害主泵，檢測(cè)器的流動(dòng)池中也會(huì)有氣泡。溶劑需脫氣，首先將溶劑煮沸，再通過精心設(shè)計(jì)的儲(chǔ)層將氣體擋在外面。后來(lái)SpectraPhysics發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)液罐中的氦噴射阻止了空氣在溶劑中的溶解，并允許低壓混合有效地用于HPLC泵。再后來(lái)，膜脫氣器取代了氦氣噴射，成為今天所有HPLC/UHPLC的一部分。

Fittings（色譜接頭）也令人頭疼。通常情況下，過度擰緊配件會(huì)導(dǎo)致潛在泄漏，并在重新連接時(shí)表現(xiàn)不佳；來(lái)自不同公司的Fittings不兼容會(huì)產(chǎn)生死體積。Upchurch Scientific發(fā)明了手緊型接頭（Fingertight fittings），易于重復(fù)使用，并耐受非常高的壓力。

HPLC的出現(xiàn)不過三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，應(yīng)用十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、恒溫器、記錄儀等主要部件。

高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除銹劑的分析等物質(zhì)的分析。