液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，指液相色譜和質(zhì)譜兩套分析系統(tǒng)的“聯(lián)用”。

色譜的優(yōu)勢(shì)在于分離，為混合物的分離提供了最有效的選擇，但其難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比來(lái)判斷未知物，對(duì)無(wú)紫外吸收化合物的檢測(cè)還要通過(guò)其它途徑進(jìn)行分析。質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進(jìn)行純化，具有一定的純度之后才可以直接進(jìn)行分析。兩套系統(tǒng)聯(lián)用可發(fā)揮出更大的優(yōu)勢(shì)。

液質(zhì)聯(lián)用中的液相色譜

液相色譜的構(gòu)造分為五大部分：進(jìn)樣部分(手動(dòng)進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣)，驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的色譜泵，主導(dǎo)分離的色譜柱(有些配柱溫箱)，檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)。

當(dāng)同質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，質(zhì)譜成為液相色譜的檢測(cè)器，而為了同步數(shù)據(jù)采集及分析，色譜廠商通常開(kāi)放接口，讓質(zhì)譜廠商的軟件來(lái)控制液相色譜的進(jìn)樣和分離，數(shù)據(jù)分析也交給質(zhì)譜廠商。

液相色譜結(jié)構(gòu)圖

當(dāng)液質(zhì)聯(lián)用時(shí)，通常在色譜柱前端加裝短的保護(hù)柱來(lái)延長(zhǎng)色譜柱壽命。若固定相使用未經(jīng)修飾的氧化硅顆?；蛐揎椘渌邩O性物質(zhì)，如氨基或氰基，則成為正相色譜，適合分析極性較強(qiáng)的分析物，洗脫時(shí)可通過(guò)調(diào)配極性差異大的兩種流動(dòng)相溶液(如水和乙腈)比例，而得到適當(dāng)極性的單一流動(dòng)相溶液進(jìn)行等度洗脫。在復(fù)雜樣品中，若要獲得好的分離度，可以使用極性差異大的兩種流動(dòng)相溶液(如水和乙腈)進(jìn)行梯度洗脫。若固定相為經(jīng)過(guò)C18、C8或苯基柱，則稱為反相色譜，適合分析低極性的化合物，亦可以進(jìn)行等度或梯度洗脫。

在聯(lián)用中，大都使用內(nèi)徑2.1mm或1mm的色譜柱，其流動(dòng)相流速分別為約200-300 μL/min和50-75μL/min，有些情況下可使用4.6mm的色譜柱，其流動(dòng)相流速為1mL/min，這時(shí)一般會(huì)在進(jìn)入質(zhì)譜前進(jìn)行分流，讓少部分進(jìn)入質(zhì)譜，而大部分分流后可進(jìn)行回收。

超高效液相色譜分離時(shí)，固定相顆粒從5μm降至3μm與1.7μm以下，這時(shí)分離效率更高，但同時(shí)需要超高壓液相泵(>400 bar或>6000psi)，這時(shí)分離時(shí)間縮短到數(shù)分鐘內(nèi)且不損失分離效能。在超高效液質(zhì)聯(lián)用時(shí)，其色譜峰底寬約在數(shù)秒內(nèi)，因此在質(zhì)譜方法設(shè)定上，需適當(dāng)調(diào)整掃描速度以獲得足夠質(zhì)譜圖數(shù)，從而完整描繪色譜峰。

納升級(jí)流速液質(zhì)聯(lián)用常用于蛋白質(zhì)組學(xué)等復(fù)雜微量樣品的分析。

降低柱內(nèi)徑可以得到較低的死體積，同時(shí)柱效大幅提高。例如，若原本用2.1mm的色譜柱分析樣品，當(dāng)轉(zhuǎn)換至使用內(nèi)徑75μm毛細(xì)管柱且注入相同樣品濃度時(shí)，理論上樣品峰濃度將會(huì)增加至約784倍。因此使用毛細(xì)管色譜柱對(duì)于電噴霧質(zhì)譜儀(濃度靈敏檢測(cè)器)的信號(hào)提升將非常顯著。此時(shí)，達(dá)到理想理論塔板數(shù)的最佳流速約為255 nL/min，理想進(jìn)樣體積約24nL，這時(shí)需要更細(xì)微的注射器，不易實(shí)現(xiàn)。

目前普遍的做法是，利用柱前端在線預(yù)濃縮方式，將微升級(jí)的樣品體積濃縮在色譜柱的最前端以縮小樣品體積。另一方面，由于樣品承載量減少，超載的樣品量容易造成柱分離效率降低。為解決此問(wèn)題，可在色譜分離柱的前端加入一個(gè)捕集柱(Trap Column)，捕集柱的功能包含了樣品預(yù)濃縮與去除過(guò)多的樣品量。為匹配納升級(jí)流速，一般需要納升電噴霧接口。商品化的納升級(jí)流速液質(zhì)聯(lián)用構(gòu)建上，常使用一個(gè)六通閥連接捕集柱與分離柱，在捕集柱進(jìn)行預(yù)濃縮時(shí)同時(shí)去除大部分樣品中的鹽類，濃縮后洗脫樣品到分離柱進(jìn)行樣品分離。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜

質(zhì)譜主要由樣品入口、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器(許多質(zhì)譜的離子源)均在真空中，由真空泵來(lái)提供所需真空度。

質(zhì)譜主要測(cè)定的是帶電離子的質(zhì)量，即質(zhì)荷比(m/z)。在液質(zhì)聯(lián)用中，樣品入口即液相色譜的流出端接入離子源，在離子源和質(zhì)量分析器之間的離子傳輸也挺重要。

質(zhì)譜結(jié)構(gòu)示意圖

質(zhì)譜離子化方法

? 電噴霧電離(ESI)

電噴霧離子源能夠?qū)⑷芤褐械膸щ婋x子在大氣壓下，經(jīng)由電噴霧過(guò)程轉(zhuǎn)換為氣相離子，再導(dǎo)入質(zhì)譜儀分析。除了大分子的分析，電噴霧也適用于分析極性小分子，并具有高靈敏度，同時(shí)非常容易與HPLC在線聯(lián)用，因此是LC-MS的最主要離子源接口。

? 納噴霧電離(Nanospray Ionization)

利用石英毛細(xì)管制成內(nèi)徑約1μm的噴嘴，可在25nL/min極低流速下穩(wěn)定電噴霧，這即被稱為納噴霧離子源。這時(shí)的噴針和入口方向是平行甚至直對(duì)質(zhì)譜入口，且能承受溶液中較高濃度鹽類污染物的影響，基質(zhì)效應(yīng)較不明顯。廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，且近年來(lái)出現(xiàn)了很多納升流速的液相色譜儀，從而使LC-MS稱為微量分析的利器。

? 大氣壓化學(xué)電離(APCI)

將原GC-MS上使用的CI化學(xué)電離方法擴(kuò)展到大氣壓下進(jìn)行，基本原理是離子/分子反應(yīng)，但APCI借助電暈放電產(chǎn)生試劑離子。此方法利用高電壓(5-6kV)金屬針?lè)烹姰a(chǎn)生等離子體區(qū)域，通常以氮?dú)庾鳛樵噭怏w，經(jīng)由電暈放電產(chǎn)生一次離子，再與汽化的溶劑反應(yīng)，產(chǎn)生二次反應(yīng)氣體粒子，再與溶質(zhì)進(jìn)行離子/分子反應(yīng)，如發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而使被分析物離子化。APCI更適用于弱極性/中等極性的小分子，其在僅有電場(chǎng)作用的ESI下難以離子化。

? 大氣壓光致電離(APPI)

利用光能激發(fā)氣態(tài)被分析物分子，使其離子化為自由基離子，或進(jìn)一步將被分析物質(zhì)子化生成離子。APPI有時(shí)也使用摻雜劑如甲苯、丙酮來(lái)幫助被分析物離子化，具有分析極低極性或非極性物質(zhì)的能力。

? 常壓敞開(kāi)式電離

解吸電噴霧電離(Desorption Electrospray Ioniztion，DESI)和 實(shí)時(shí)直接分析(Direct Analysis in Real Time，DART) 統(tǒng)稱為常壓敞開(kāi)式離子化(Ambient Ionization)。常壓敞開(kāi)式離子化法適合分析存在于物體表面的物質(zhì)，可在現(xiàn)場(chǎng)分析，分析速度快，在環(huán)境檢測(cè)、食品安全、犯罪物證鑒定、臨床標(biāo)志物檢測(cè)等需要快速現(xiàn)場(chǎng)分析的領(lǐng)域具有前景；在近年來(lái)高熱度的質(zhì)譜成像、空間定位組學(xué)等領(lǐng)域發(fā)表了許多前沿成果。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜：質(zhì)量分析器

在離子源離子化后，離子經(jīng)過(guò)離子傳輸部分(習(xí)慣上稱為Q0區(qū))進(jìn)入后續(xù)的質(zhì)量分析器。

質(zhì)量分析器有這七種：扇形磁場(chǎng)、四極桿、離子阱、飛行時(shí)間、FTICR、Orbitrap、Astral。扇形磁場(chǎng)常配合EI源使用，所以在LC-MS中不再介紹。下面分別介紹其它6種。

? 四極桿Quadruple

其原理是控制離子隨著交流(AC)、直流(DC)電場(chǎng)運(yùn)動(dòng)。在特定電場(chǎng)作用下，離子運(yùn)動(dòng)軌跡與質(zhì)荷比有關(guān)，如果運(yùn)動(dòng)軌跡不穩(wěn)定就會(huì)撞擊分析器的電極或偏離電場(chǎng)區(qū)無(wú)法被利用。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)控制電場(chǎng)可選擇特定質(zhì)荷比的離子穩(wěn)定地通過(guò)四極桿到達(dá)檢測(cè)器。

? 離子阱Ion Trap

屬于四極質(zhì)量分析器，不同的是在z軸增加了一個(gè)束縛場(chǎng)，形成一個(gè)可以捕獲離子的三維電場(chǎng)。它由一對(duì)環(huán)形電極和一對(duì)上下對(duì)稱的端蓋電極組成，這些電極的幾何形狀為雙曲面。當(dāng)離子阱要捕獲所有離子時(shí)，常關(guān)閉直流電場(chǎng)僅保留交流電場(chǎng)。當(dāng)掃描離子時(shí)，在環(huán)形電極加入射頻場(chǎng)(即交流電場(chǎng))，而上下端蓋電極則同時(shí)接地。通過(guò)掃描環(huán)形電極的交流電場(chǎng)可使離子逼近不穩(wěn)定區(qū)而離開(kāi)離子阱進(jìn)入檢測(cè)器。

? 二維線性離子阱Linear Trap

三維離子阱的容量較小，有效捕獲區(qū)域小，為了增加離子阱的容量、提升靈敏度、分辨率等性能，質(zhì)譜學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了二維線性離子阱，即在二維四極桿的軸向方向，用電場(chǎng)將離子束縛起來(lái)，可將被捕獲離子的數(shù)量從百萬(wàn)個(gè)提升到千萬(wàn)個(gè)。

? 飛行時(shí)間TOF

利用靜電場(chǎng)加速離子后，以離子飛行速度差異來(lái)分離不同質(zhì)荷比的離子。在施加同樣能量的電場(chǎng)后，離子進(jìn)入一個(gè)無(wú)場(chǎng)的飛行管，質(zhì)荷比大的離子飛得慢，質(zhì)荷比小的離子飛得快。TOF的突出優(yōu)點(diǎn)是：在分辨率、靈敏度、速度方面均有不錯(cuò)的綜合表現(xiàn)，反射型TOF常?？梢垣@得超過(guò)10,000的高分辨，全掃描時(shí)的譜圖采集速度很快。

? 傅里葉變換離子回旋共振FT-ICR

FT-ICR的質(zhì)量分析器由捕獲電極、激發(fā)電極和檢測(cè)電極組成，其結(jié)構(gòu)可以是立方體、圓柱形或長(zhǎng)方體等。離子在均勻的磁場(chǎng)中做回旋運(yùn)動(dòng)，當(dāng)離子回旋頻率與激發(fā)電極發(fā)出的射頻電場(chǎng)頻率相當(dāng)而產(chǎn)生共振時(shí)，離子運(yùn)動(dòng)半徑會(huì)逐漸擴(kuò)大到足以在兩個(gè)平行的檢測(cè)電極上感應(yīng)產(chǎn)生像電荷。此時(shí)關(guān)閉激發(fā)電極的無(wú)線電場(chǎng)，并記錄像電荷形成時(shí)域的ICR信號(hào)，使用傅里葉變換可將時(shí)域信號(hào)轉(zhuǎn)換成頻域譜圖，譜圖中的頻率為離子質(zhì)量與電荷的函數(shù)，所以可以直接轉(zhuǎn)換為質(zhì)譜圖。值得注意的是，F(xiàn)T-ICR不需要將離子傳送到檢測(cè)器中，它檢測(cè)的是感應(yīng)信號(hào)。

? 軌道阱Orbitrap

利用直流電場(chǎng)將離子局限于阱中，并運(yùn)用傅里葉變換技術(shù)將時(shí)域信號(hào)轉(zhuǎn)換到頻域，再經(jīng)換算得到離子的質(zhì)荷比信號(hào)。離子被局限在固定的軌道內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間高速周期運(yùn)動(dòng)，因此可獲得數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)的高分辨率。在獲得與FT-ICR近似分辨率性能的同時(shí)，Orbitrap不使用強(qiáng)磁場(chǎng)而使用直流電場(chǎng)，使用簡(jiǎn)單、維護(hù)成本低，是近年來(lái)質(zhì)譜領(lǐng)域的重大突破。

? 非對(duì)稱軌道無(wú)損質(zhì)量檢測(cè)器(Asymmetric Ion Mirrors, Astral)

目前它主要用于和Orbitrap配合使用，主要用于串聯(lián)MS/MS檢測(cè)。總體原理有點(diǎn)像多次往返的TOF，但離子的飛行軌道和傳統(tǒng)TOF非常不同。它的主要特點(diǎn)是：可以在高達(dá)200 Hz的速度下碎裂離子，同時(shí)分辨率達(dá)到8萬(wàn)。Astral不是TOF，而是結(jié)合了TOF、離子阱和Orbitrap技術(shù)的一種新型分析器。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜：檢測(cè)器

? 電子倍增器(Electron Multiplier，EM)

離散金屬板的串聯(lián)連接，可將離子電流放大約108到可測(cè)量的電子電流。原理是讓離子撞擊到容易釋放出二次電子的材質(zhì)表面，二次電子經(jīng)由重復(fù)撞擊相同材質(zhì)連續(xù)放大二次電子數(shù)目后，再記錄二次電子數(shù)量來(lái)達(dá)到檢測(cè)目的。電子倍增器依據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為不連續(xù)式與連續(xù)式兩種，前者面積大但動(dòng)態(tài)范圍寬，后者面積小適用于空間有限的分析器，但動(dòng)態(tài)范圍窄?？偟膩?lái)說(shuō)，電子倍增器的響應(yīng)時(shí)間約為20ns，不適合TOF，常用于四極桿、離子阱。

? 微通道板(Microchannel Plate，MCP)檢測(cè)器

微通道板MCP類似于連續(xù)式電子倍增器，只是它將每個(gè)微小化的電子倍增器做成數(shù)組形態(tài)，并集中在一只半導(dǎo)體圓盤上。由于電流信號(hào)的時(shí)間半高寬通常小于2ns，適用于TOF。MCP最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)為二片堆疊式，當(dāng)離子撞擊進(jìn)入MCP中，其效果類似于連續(xù)式電子倍增器，二次電子反復(fù)撞擊通道內(nèi)部表面產(chǎn)生大量二次電子。MCP的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)面積大、增益值高、反應(yīng)速度快、甚至可搭配熒光屏或數(shù)組式收集信號(hào)電極變成離子圖像檢測(cè)器。

? 無(wú)增益式離子檢測(cè)器

本身不放大離子信號(hào)，只作為收集離子電流或感應(yīng)離子電荷的簡(jiǎn)單裝置。其結(jié)構(gòu)主要由檢測(cè)離子的電極和在后端的信號(hào)放大電路構(gòu)成。一般用來(lái)檢測(cè)離子的電極稱做法拉第電極，而此電極依其形狀又常被稱為法拉第板或法拉第杯。法拉第杯通常直接放置在離子路徑上收集離子，而法拉第板則可直接收集離子或安裝于離子路徑旁感應(yīng)離子信號(hào)。

? 閃爍檢測(cè)器(Scintillation Detector)

也稱達(dá)利檢測(cè)器(Daly Detector)，其原理也是離子轉(zhuǎn)換為二次電子，但產(chǎn)生二次電子數(shù)目沒(méi)有被放大，而是直接加速撞擊高效率的熒光屏后發(fā)光，然后光子再由極為靈敏的光電倍增管檢測(cè)并放大成電子信號(hào)。該檢測(cè)器的增益比高，但只適用于正離子，信號(hào)響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且需要高真空，體積較大。許多早期使用該檢測(cè)器的質(zhì)譜都已改成電子倍增器。目前，商業(yè)質(zhì)譜儀常以轉(zhuǎn)換二次發(fā)射電極搭配電子倍增器使用，來(lái)增加儀器靈敏度。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜：真空系統(tǒng)

真空是質(zhì)譜儀運(yùn)作的必要條件之一，也是操作質(zhì)譜儀前首先要準(zhǔn)備的工作。真空度越高，代表氣體壓力越低。大多數(shù)質(zhì)譜儀都必須串聯(lián)低真空及高真空兩種泵，而且開(kāi)啟時(shí)必須循序啟動(dòng)。質(zhì)譜常用真空泵有三類。

? 粗抽泵(Roughing Pump)

適用于1000~10^-3 mbar。機(jī)械泵(Mechanical Pump)、隔膜泵(Diaphragm Pump)及渦卷式泵(Scroll Pump)都屬于粗提泵，或前級(jí)泵(Fore Pump)，需要機(jī)油潤(rùn)滑和經(jīng)常性保養(yǎng)，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)會(huì)產(chǎn)生噪聲和高溫。

? 高真空泵(High Vacuum Pump)

適用于10^-4~10^-9 mbar。渦輪分子泵(Turbomolecular Pump)、擴(kuò)散泵(Diffusion Pump)及低溫泵(Cryopump)屬于高真空泵。渦輪泵和擴(kuò)散泵都必須在排氣口連接一個(gè)粗提泵。一般液質(zhì)聯(lián)用上使用的高真空泵均為渦輪分子泵。

? 超高真空泵(Ultrahigh Vacuum Pump)

適用于10^-4~10^-11 mbar。包括低溫泵和離子泵(Ion Pump)，可將腔體內(nèi)壓力降到超高真空。但低溫泵需超低溫，離子泵體積特別大。超高真空壓力范圍也可以串聯(lián)幾個(gè)分子渦輪泵來(lái)實(shí)現(xiàn)。

液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。