顯微鏡技術(shù)是人類進(jìn)入原子時代的標(biāo)志。

它把一個全新的世界展現(xiàn)在人類的視野里，人們第一次看到了數(shù)以百計的“新的”微小動物和植物，以及從人體到植物纖維等各種東西的內(nèi)部構(gòu)造。它還有助于科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新物種，有助于醫(yī)生治療疾病，正逐漸被研究人員采用，因?yàn)樗軌蛟谑褂脭?shù)百、數(shù)千甚至數(shù)百萬種新化合物治療后，對許多細(xì)胞的單細(xì)胞活性進(jìn)行無偏倚的多參數(shù)可視化和量化。

顯微鏡技術(shù)在過去幾十年所取得的驚人進(jìn)步，使得HCI(高內(nèi)涵成像，High content imaging)才成為可能。

具體來說，顯微鏡現(xiàn)在能夠通過自動化程序獲取大量圖像。簡單點(diǎn)說，HCI是一種基于圖像的高通量細(xì)胞篩選方法，它將自動多色熒光成像與量化數(shù)據(jù)分析相結(jié)合，以同時評估2D和3D細(xì)胞培養(yǎng)中單個細(xì)胞的多種分子特征，以及其他生物樣本類型。

高內(nèi)涵成像(HCI)

“HCI”這一術(shù)語用于指代基于圖像的主要基礎(chǔ)自動化高通量技術(shù)。通常指單個細(xì)胞的多個分子參數(shù)/特征(使用熒光染料測量)可以同時被評估，例如細(xì)胞周期狀態(tài)、細(xì)胞和核形態(tài)、細(xì)胞活性、受體內(nèi)化、蛋白質(zhì)聚集等。

HCI方法用于測量和監(jiān)測表型變化，以優(yōu)化發(fā)現(xiàn)和開發(fā)研究，以及早期的發(fā)現(xiàn)和高通量篩選(HTS)，從而實(shí)現(xiàn)命中先導(dǎo)物和先導(dǎo)物的優(yōu)化。最終目標(biāo)是得出一系列可靠數(shù)據(jù)，通過更為直觀地理解化合物與靶點(diǎn)在細(xì)胞水平上的相互作用，為后期做出是否繼續(xù)的決定提供支持。

正常和癌癥類器官單獨(dú)和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)的代表性多參數(shù)HCI圖像

正常結(jié)腸類器官(左上)

結(jié)直腸癌類器官(右上)

類腫瘤加髓細(xì)胞(左下)

類器官加免疫細(xì)胞(右下)

高內(nèi)涵篩選(HCS)

HCS，可稱為高內(nèi)涵成像與分析系統(tǒng)，是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，通過自動化細(xì)胞成像分析的方法，能快速、批量、自動地捕獲細(xì)胞、亞細(xì)胞或組織圖像，并對細(xì)胞表型進(jìn)行量化處理，批量實(shí)現(xiàn)圖片信息到數(shù)值信息的轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)了高通量圖像信息的自動提取和分析。

HCS的目的類似于其他傳統(tǒng)HTS(高通量篩選)方法，目標(biāo)是篩選數(shù)百萬種到數(shù)億種化合物，確定新的藥物靶點(diǎn)和命中率，或在復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)(包括球體和類器官等3D培養(yǎng)物)中進(jìn)行靶點(diǎn)和先導(dǎo)物優(yōu)化。

HCS采用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，可以獲得被篩樣品對細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時快速的生物效應(yīng)信息，在細(xì)胞水平上檢測多個指標(biāo)的多元化，功能性篩選。與基于讀板儀(酶標(biāo)儀)的傳統(tǒng)HTS相比，HCS被認(rèn)為更具可預(yù)測性，因?yàn)楦邇?nèi)涵成像(HCI)篩選法可顯示細(xì)胞對化合物反應(yīng)的表型數(shù)據(jù)，而其可能同一個實(shí)驗(yàn)中的在靶效應(yīng)和/或脫靶效應(yīng)有關(guān)。盡管在實(shí)驗(yàn)的規(guī)劃階段必須考慮可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)噪聲、工作流挑戰(zhàn)和數(shù)據(jù)存儲容量，但通過使用多路復(fù)用技術(shù)，可以監(jiān)控多個終點(diǎn)。

多個特征的HCS數(shù)據(jù)輸出的代表性熱圖示例

(左)對細(xì)胞核和肌動蛋白的快速分析

(右)全z疊加分析在一次檢測中產(chǎn)生300多種形態(tài)特征

雖然HCI硬件的發(fā)展速度非常快，但分析軟件的發(fā)展速度卻沒跟上。這意味著HCS實(shí)驗(yàn)往往沒有發(fā)揮其潛力。在應(yīng)用方向上，根據(jù)相關(guān)研究，HCS的主要用途是小分子藥物的發(fā)現(xiàn)(87%)、細(xì)胞行為或分化(59%)、細(xì)胞機(jī)理研究(57%)以及比較少的是細(xì)胞安全/毒理學(xué)研究(35%)。HCS在細(xì)胞活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、毒性檢測、受體蛋白轉(zhuǎn)位、蛋白相互作用等許多方面都有很好的應(yīng)用，是藥物篩選等重要研究工具。

高內(nèi)涵分析(HCA)

HCA將多參數(shù)算法應(yīng)用于HCS數(shù)據(jù)，適用于從基礎(chǔ)科學(xué)到藥物發(fā)現(xiàn)篩選的一系列研究應(yīng)用，可識別小分子、肽、RNAi、藥物混合物或抗體的表型或靶反應(yīng)。

基于高分辨率顯微圖像，HCA在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各個環(huán)節(jié)的影響, 在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量與基因及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息, 確定其生物活性和潛在毒性的過程。因此該技術(shù)可作為一個強(qiáng)大的工具來研究生理活性物質(zhì)(如化合物、siRNA、 肽和抗體)的影響，并可以培養(yǎng)如斑馬魚這樣整個生物體的細(xì)胞和組織樣本。

HCA通過在復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)(包括來自球體、類器官和共培養(yǎng)物以及微環(huán)境的多細(xì)胞結(jié)構(gòu))的背景下開發(fā)詳細(xì)的細(xì)胞生理學(xué)特征，實(shí)現(xiàn)對來自HCS的命中率進(jìn)行優(yōu)化這一目標(biāo)。換言之，精密的HCA算法現(xiàn)在能夠在HCS實(shí)驗(yàn)中對細(xì)胞系進(jìn)行非常復(fù)雜的分析，最終提供具備高度可預(yù)測性和高度可轉(zhuǎn)化性的臨床前數(shù)據(jù)來預(yù)測體內(nèi)效應(yīng)。

用于生成復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)詳細(xì)特征的類器官的HCA圖像示例

高內(nèi)涵成像/篩選/分析與類器官相結(jié)合的分析應(yīng)用

類器官是微型化和簡化的體外器官模型系統(tǒng)，是組織發(fā)育和疾病模型建立、個性化醫(yī)學(xué)、藥物篩選和細(xì)胞治療等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。類器官又被稱為迷你器官，這是一種被定義為體外培養(yǎng)的能夠自我更新、自我組織，并具有來源組織器官功能的3D細(xì)胞簇，其來源于組織中的一個或幾個細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞(ESCs)、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSC)和成體干細(xì)胞(ASCs)，這些干細(xì)胞可以擴(kuò)展為多種組織類型。類器官通常包含細(xì)胞的共培養(yǎng)物并顯示出高度的自組裝性，因此與傳統(tǒng)的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)物相比，可以更好地顯示復(fù)雜的體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)答以及相互作用。

在類器官自動成像中，改善類器官表型變化的定量評估以及增加實(shí)驗(yàn)和檢驗(yàn)中通量而言，類器官的自動成像和分析是非常重要的。共聚焦成像系統(tǒng)經(jīng)常被用來深入評估類器官的形態(tài)。而3D類器官培養(yǎng)被視為HCS里最需要共聚焦模式成像的應(yīng)用，共聚焦成像對于捕獲3D生物檢測分析的復(fù)雜性尤其有用。

如前所述，HCS可與類器官結(jié)合使用，其顯著的臨床可預(yù)測性與在原始組織中觀察到的關(guān)鍵表型(如結(jié)構(gòu)和細(xì)胞異質(zhì)性)和遺傳特征的重現(xiàn)有關(guān)。在腫瘤學(xué)項(xiàng)目的背景下，腫瘤類器官具有高度的臨床相關(guān)性，是發(fā)現(xiàn)藥物和生物標(biāo)志物的良好平臺。

基于圖像的高通量技術(shù)能夠開發(fā)具備高度可預(yù)測性和高度可轉(zhuǎn)化性的臨床前數(shù)據(jù)，以預(yù)測體內(nèi)效應(yīng)，尤其是與高度患者相關(guān)的3D類器官培養(yǎng)相結(jié)合時。高內(nèi)涵分析工具能夠確定和測定每個類器官中的單個細(xì)胞、細(xì)胞核或細(xì)胞器。并對活細(xì)胞、細(xì)胞或有特異性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并且能夠確定其體積大小以及彼此間的距離。

因此，3D類器官結(jié)構(gòu)的成像系統(tǒng)需要滿足的條件首先成像放大系統(tǒng)，照明的靈活性以及提高圖像采集速度的模式。當(dāng)空間尺度較小的細(xì)胞團(tuán)成像時，需要的條件包括具有系統(tǒng)的高靈敏度，比如系統(tǒng)的高激發(fā)效率和成像檢測器的高靈敏度。系統(tǒng)的高激發(fā)效率保證了只需要較低的激發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對整個細(xì)胞團(tuán)的激發(fā)。其次便是成像系統(tǒng)能夠高速成像。

目前，HCS系統(tǒng)正越來越多地用于3D細(xì)胞模型和表型分析的分析，在未來也將發(fā)揮著越來越重要的作用。